微生物群落多样性测序-食品安全检测@卡文思

一、概述

微生物多样性测序，又名扩增子测序，是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，主要包括16S rRNA测序、18S rRNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。采用第二代高通量测序平台测定的16S/18S /ITS某个高变区域的序列，来反映环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用。

二、服务产品

1、16S rDNA测序

16S rRNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，主要进行细菌或古菌的多样性分析。细菌核糖体RNA（rRNA）有三种类型：5S rRNA（120bp）、16S rRNA（约1540bp）和23S rRNA（约2900bp）。5S rRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析鉴定；23S rRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16S rRNA普遍存在于原核细胞中，且含量较高、拷贝数较多（占细菌RNA总量的80%以上），便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌多样性分析的标准。16S rRNA编码基因序列共有10个保守区和9个高可变区。

2、18S rDNA测序

18S rRNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，反映样品中真核生物之间的种类差异。与细菌多样性分析类似，在真核微生物中也有三类核糖体RNA（rRNA），包括5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，其中既有保守区，也有可变区（V1-V9，没有V6区）。保守区域反映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则能体现物种间的差异，适用于作种级及以上的分类标准。

3、ITS测序

该类测序主要对环境微生物中的真菌多样性进行分析。包含两个区域：ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间；ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。 ITS序列是内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer），位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2。在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有较高的保守性，而ITS由于承受较小的自然选择压力，在进化过程中能够容忍更多的变异，在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时，ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异较明显，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异。并且ITS序列片段较小（ITS 1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp），易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。

4、功能基因扩增子测序

根据客户的研究需求，基于功能基因/持家基因/靶基因等，对特定基因的PCR产物进行测序。在自然界的各类环境中，都有微生物的存在，它们在各自的“岗位”上都发挥着或大或小、或多或少的作用。有一些具有特殊功能的微生物，由于其作用的重要性或特殊性而受到人们的广泛关注，这些具有特殊功能的微生物叫做功能微生物，如氨氧化细菌、硫细菌、硝化细菌等。它们在分类学上有可能差异很大，但却具有相同或类似的基因使其能够发挥同样的作用。支配这些功能细菌发挥重要功能的基因被称为功能基因，如amoA、dsrB、nxrA。

三、二代多样性实验流程

四、二代多样性分析流程

五、送样要求

产品类型	送样类型	浓度要求	送样量
扩增子（16s/18s/ITS）	DNA	≥ 5 ng/μL	≥ 500 ng（单个区域扩增子）
	PCR	≥ 10 ng/μL	≥ 500 ng
	土壤、淤泥、沉积物	-	≥ 3 g
	粪便	-	≥ 1 g
	组织样本	-	≥ 1 g
	水体样为滤膜	-	≥ 1 张
	拭子样品	-	≥ 2 个